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免疫荧光的实验步骤及建议
发布时间:2018-03-20 点击次数:724次
   免疫荧光将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。免疫荧光此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
  
  免疫荧光步骤基本一致:
  
  1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。
  
  2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。
  
  3.0.2%TritonX-100通透10分钟,PBS洗三遍。
  
  4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。
  
  5.一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。
  
  6.二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。
  
  7.zui好用DAPI染核,然后直接照荧光片。
  
  8.蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
  
  建议:1.还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。2.免疫荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。

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