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耐药细胞株构建实验如何进行?
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  肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一,成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。因此,探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程,它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科,这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的,因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。
  
  一种药物长期作用于某类细胞,杀死其中没有抗性的细胞,而对这类细胞中具有抗性的细胞不能杀死,即进行了选择。具有抗性的细胞大量繁殖产生很多抗性后代,但再用这种药物时表现出的药效大大下降的现象就是细胞的耐药性,采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性,从而构建出对特定药物产生耐药性的肿瘤细胞株。
  
  耐药细胞株构建实验:
  
  原理:细胞与低剂量的药物长期接触,引起细胞本身药物化学过程的改变,细胞膜上出现Pgp糖蛋白,使细胞逐渐对药物耐受,随着药物浓度的递增,其耐受程度逐渐加强。
  
  实验材料及试剂
  
  培养瓶、CO2培养箱、酒精灯、移液枪等;血清培养液、PBS、相应作用的药物等。
  
  实验内容
  
  大剂量间隙作用:对数生长期的细胞接种于培养瓶中,生长至70%~80%汇合时,将处于对数生长期的肿瘤细胞置于含有指定浓度的药物浓度的培养液中培养,弃去培养液,PBS清洗2遍,更换不含药物培养基,常规培养,待细胞恢复生长,培养一段时间后更换不含药物的RPMI-1640(DMEM)胎牛血清培养液继续培养。待细胞稳定生长、进入对数生长期后,传代两次,再将筛选出的细胞在指定浓度的药物浓度培养液中继续培养依这样不断改变作用时间,共经过1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10个作用时间段,约8个月的培养,最终使得细胞能够在一定浓度的药物的培养液中持续稳定生长并传代,然后脱药培养1个月在检测细胞的生物特性及耐药指标。
  
  浓度梯度递增间隙作用:采用药物浓度递增培养法冲击诱导,对数生长期的细胞接种于培养瓶中,细胞处于60~70%浓度对数期生长时,加入起始浓度为低浓度的药物作用24h,弃去培养液,PBS清洗2遍,更换不含药物培养基,细胞恢复生长后,消化传代复以低浓度作用细胞24h,待细胞增殖至正常形态后,重复上述药物冲击,每种浓度冲击8次。待细胞在此浓度稳定生长后,提高药物浓度继续培养,药物依次递增浓度加药。药物诱导历时大约9个月,直到细胞能够在指定浓度的药物中稳定生长。

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